Wako SeeDB 实现生物体样本深层成像

今井猛博士等人开发了一种对于水溶性生物体组织的形态和组成在不破坏荧光蛋白以及荧光神经示踪剂的条件下,可快捷简便地使大脑等生物体组织透明化的方法——SeeDB（See Deep Brain）。SeeDB 由水、果糖、还原剂构成。

SeeDB 法是在使用共聚焦显微镜和双光子激发显微镜下可深层成像的方法。可利用荧光蛋白和神经示踪剂，实现对荧光神经回路的全貌阐明和定量分析等各种各样的应用。

SeeDB 法，可用于脊椎动物的各种组织，下面以小鼠大脑为例进行介绍。

①将小鼠大脑在4%多聚甲醛/PBS，4℃下固定过夜。

②样本用PBS清洗三次（每次清洗10分钟）

③　将样本加入放有20 mL的SeeDB:20 w/v%果糖溶液的50 mL锥形瓶中。

在室温下在旋转器中旋转4-8小时（约4 rpm）

在脆弱的样本和薄片情况也可以用压板式摇床（约17 rpm）

④　将样本加入放有SeeDB:40 w/v%果糖溶液的50 mL锥形管中，室温下旋转4-8小时。

⑤　将样本加入放有SeeDB:60 w/v%果糖溶液的50 mL锥形管中，室温下旋转4-8小时。

⑥　将样本加入放有SeeDB:80 w/v%果糖溶液的50 mL锥形管中，室温下旋转12小时。

⑦　将样本加入放有SeeDB:100 w/v%果糖溶液的50 mL锥形管中，室温下旋转12小时。

⑧　将样本加入放有SeeDB的50 mL锥形管中，室温下旋转24小时。

最长时间可延长至48小时。在透明化成功时，透光可观察到组织透明化。

⑨　将SeeDB处理过的大脑样本置于共聚焦显微镜或双光子激发显微镜下观察。

样本用SeeDB液固定。用SeeDB透明化处理后的样本折射率可达到1.49。因此，物镜中应该有甘油浸没透镜、油镜、透明化用镜片，即使浸水镜头到达2 mm深度也是没有问题的。浸没式镜片请使用浸没液，SeeDB不能用作浸没液。在使用干式镜头（折射率1.0）和浸水镜头（折射率1.33）获取画像情况下，需要补正深度值（补正值请参考相关文献）。

SeeDB生物体样本透明化

左起依次为经SeeDB液透明化处理的小鼠幼胎（幼胎12天）

新生鼠（生后3天）的全脑、成鼠大脑（8周龄，厚度2 mm）

双光子激发显微镜下的Thy1-YFP-H小鼠 （10周龄）大脑荧光成像 使用Olympus公司产品  多光子专用物镜：XLPLN10XSVMP观察案例	共聚焦显微镜下的Thy1-YFP-H小鼠 （10周龄）大脑荧光成像 使用Olympus公司产品 有机硅浸没式物镜：UPLSAPO 10X2观察案例

双光子激发显微镜下的Thy1-YFP-H小鼠

（10周龄）大脑荧光成像

使用Olimpus公司产品

多光子专用物镜：XLSLPLN25XGMP观察案例

比例尺：100 μm

小鼠大脑固定后用Dil标记，SeeDB透明化处理案例

左：嗅球僧帽细胞树突（横向观察）

右：嗅球僧帽细胞树突（纵向观察）

使用Olympus公司产品

有机硅浸没型物镜：UPLSAPO 20X观察案例。比例尺：100 μm。