副流感病毒（HPIV1、2、3型）抗原检测-免疫层析 （胶体金、彩色乳胶及荧光免疫层析）解决方案

副流感病毒（parainfluenza viruses，HPIV）隶属副黏病毒科（Paramyxoviridae），根据基因组特征及血清学特点，HPIV分为HPIV-1~4血清型，其中HPIV-1和HPIV-3为呼吸道病毒属（Respirovirus），HPIV-2和HPIV-4为腮腺炎病毒属（Rubulavirus）。HPIV在电镜下多呈球形，直径125~250nm，基因组约15500个核苷酸。其基因组可编码6种结构蛋白，如图1所示，包括核蛋白NP蛋白（nucleoprotein，NP）、磷蛋白P蛋白（phosphoprotein，P）、基质蛋白M蛋白（matrix protein，M）、血凝素-神经氨酸酶蛋白HN蛋白（hemagglutinin-neuraminidase protein，HN）、融合蛋白F蛋白（fusion protein，F）和大蛋白L蛋白（large protein，L）。HN蛋白和F蛋白位于HPIV包膜表面，这2种蛋白是中和抗体的主要靶标。M蛋白位于包膜内层，HPIV包膜内为核衣壳，NP蛋白包裹的基因组RNA作为转录的模板，L蛋白和P蛋白形成L-P RNA聚合酶复合体。P基因还编码部分非结构蛋白，这些蛋白在不同血清型间略有不同，HPIV-1 RNA编码C蛋白，HPIV-2和HPIV-4 RNA 编码V蛋白，HPIV-3 RNA编码C蛋白和D蛋白，这些非结构蛋白不是病毒复制的必需蛋白。HPIV感染宿主细胞时与宿主细胞膜融合，释放核衣壳，L-P RNA聚合酶复合体识别模板进行转录，经核糖体翻译为病毒结构蛋白。病毒的子代RNA与NP蛋白组装形成核衣壳，既可参与下一轮转录和翻译，也可与结构蛋白结合形成新的病毒颗粒释放到细胞外。

图1 HPIV全病毒结构示意图

HPIV主要侵犯呼吸道黏膜的表层组织，在纤毛上皮细胞内复制和繁殖。感染多从鼻和口咽开始，2~5 d后可延伸至下呼吸道并达到复制高峰。HPIV常侵犯<5岁婴幼儿的气管、支气管黏膜上皮细胞，引起细胞变性、坏死增生和黏膜糜烂。当侵犯肺泡上皮细胞及间质细胞时，则引起间质性肺炎，或表现为支气管炎或肺炎。HPIV-1和HPIV-2更易感染喉及气管上段，与急性喉气管支气管炎有关。而HPIV-3感染远端气道，与支气管炎和肺炎相关。HPIV-4一般感染上呼吸道，通常症状轻。由于婴幼儿免疫系统发育不完善，免疫应答能力相对较弱，抗体持续时间较短，故易发生反复感染。疾病的严重程度取决于HPIV的感染部位、病毒载量、型别及宿主自身免疫等因素。

HPIV感染呈全球性分布，造成严重的疾病负担，不同血清型在不同地区、不同年份的流行病学特征均有差异。HPIV是儿童呼吸道感染的主要病原体之一，中国疾控中心数据显示，2009—2020年成人及儿童急性呼吸道感染患者病毒阳性率最高为流感病毒（28.5%），其次是呼吸道合胞病毒（16.8%）、鼻病毒（16.7%）和HPIV（13.1%）。HPIV检出患者以5岁以下儿童多见，其中<2岁的儿童感染率最高。<5岁儿童中大约13%的急性呼吸道感染病例、4%~14%的急性下呼吸道感染住院病例和4%的急性下呼吸道感染死亡病例都归因于HPIV感染。HPIV感染主要以HPIV-1和HPIV-3为主，2011—2019年，美国HPIV阳性患者中各型别占比分别为18%（HPIV-1）、14%（HPIV-2）、55%（HPIV-3）和13%（HPIV-4），我国多项研究同样证实HPIV-3是最主要的血清型。

实验室检测对于HPIV感染的临床诊治具有重要指导意义，目前实验室常用的检测手段包括病毒分离培养、抗原检测、血清学抗体检测、核酸检测。不同检测方法各有其优势和局限性，需要根据不同需求合理选择应用（表1）。

针对副流感病毒（HPIV1、2、3型）抗原的检测，西宝生物推出5种单克隆抗体、3种抗原及1种菌液，适合胶体金免疫层析、彩色乳胶免疫层析及荧光免疫层析平台。具体性能如下。

（以下评估仅代表在西宝生物的工艺体系下的验证，建议客户根据自身工艺进行抗体交叉配对验证）。

2.1.1 HPIV-1抗体配对组合：副流感病毒（HPIV）1&3型抗体（货号：FKY0933D）标记胶体金/彩色乳胶/荧光微球+副流感病毒（HPIV）1型抗体（货号：FKY0933C）划膜。

2.1.2 HPIV-2抗体配对组合：副流感病毒（HPIV）2型抗体（货号：FKY0934C）标记胶体金/彩色乳胶/荧光微球+副流感病毒（HPIV）2型抗体（货号：FKY0934D）划膜。

2.1.3 HPIV-3抗体配对组合：副流感病毒（HPIV）1&3型抗体（货号：FKY0933D）标记胶体金/彩色乳胶/荧光微球+副流感病毒（HPIV）3型抗体（货号：FKY0935C）划膜。

将HPIV-1抗原（货号：EKY0221B）/HPIV-2抗原（货号：EKY0221C）/HPIV-3抗原

（货号：EKY0221D）分别用合适的稀释液按照理论浓度依次稀释到如下测试浓度。

2.3反应模式：80uL样品直接上样，反应时间15min-20min。

a.胶体金免疫层析平台：采用HPIV-1抗体配对测试HPIV-1抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达50ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在胶体金层析平台测试性能良好。

b.彩色乳胶免疫层析平台：采用HPIV-1抗体配对测试HPIV-1抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达10ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在彩色乳胶层析平台测试性能良好。

c.荧光免疫层析平台：采用HPIV-1抗体配对测试HPIV-1抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达5ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在荧光免疫层析平台测试性能良好。

d.特异性：分别测试浓度为10ug/mL的腺病毒抗原、合胞病毒抗原、2019-nCOV-SRFc3cho抗原、2019-nCOV-SRHcho抗原、HPIV-2抗原、HPIV-3抗原，结果均为阴性，表明特异性良好。

图1 胶体金层析平台测试HPIV-1抗原梯度示意图

图2 彩色乳胶层析平台测试HPIV-1抗原梯度示意图

表1  HPIV-1抗体配对荧光层析平台测试HPIV-1抗原梯度数据

样本编号	HPIV1抗原梯度（ng/mL）	T	C	T/C	区分度
1	2000	126583	159545	0.793	254%
2	500	53853	172631	0.312	245%
3	200	21510	169153	0.127	186%
4	100	11268	164623	0.068	222%
5	50	5946	192848	0.031	199%
6	20	2511	161848	0.016	186%
7	10	1300	155586	0.008	144%
8	5	993	171710	0.006	229%
9	1	696	174386	0.004	/
10	0	466	170499	0.003	/
11	0	406	175013	0.002	/

a.在胶体金免疫层析平台，采用HPIV-2抗体配对测试HPIV-2抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达20ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在胶体金层析平台测试性能良好。

b.在彩色乳胶免疫层析平台，采用HPIV-2抗体配对测试HPIV-2抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达1ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在彩色乳胶层析平台测试性能良好。

测试阳性菌液可出线，与抗原梯度20ng/mL接近。

c.在荧光免疫层析平台，采用HPIV-2抗体配对测试HPIV-2抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达1ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在荧光免疫层析平台测试性能良好。

测试阳性菌液荧光强度介于抗原梯度2ng/mL与5ng/mL之间。

d.特异性：分别测试浓度为10ug/mL的腺病毒抗原、合胞病毒抗原、2019-nCOV-SRFc3cho抗原、2019-nCOV-SRHcho抗原、HPIV-1抗原、HPIV-3抗原，结果均为阴性，表明特异性良好。

图3 胶体金层析平台测试HPIV-2抗原梯度示意图

图4 彩色乳胶层析平台测试HPIV-2抗原梯度示意图

图5 彩色乳胶层析平台测试HPIV-2抗原及菌液示意图

表2  HPIV-2抗体配对荧光层析平台测试HPIV-2抗原梯度数据

样本编号	HPIV2抗原梯度（ng/mL）	T	C	T/C	区分度
1	500	405857	96728	4.1959	199%
2	200	379046	180004	2.1058	162%
3	100	286829	221237	1.296	204%
4	50	172366	270623	0.6369	264%
5	20	72251	299455	0.2413	181%
6	10	40945	307469	0.1332	212%
7	5	20516	326757	0.0628	240%
8	2	7905	302192	0.0262	158%
9	1	5004	302325	0.017	187%
10	0.5	2612	294925	0.0089	269%
11	0.1	995	301995	0.0033	/
12	0	1526	284927	0.0054	/
13	阳性菌液	12242	316293	0.0387	148%

a.在胶体金免疫层析平台，采用HPIV-3抗体配对测试HPIV-3抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达10ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在胶体金层析平台测试性能良好。

b.在彩色乳胶免疫层析平台，采用HPIV-3抗体配对测试HPIV-3抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达5ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在彩色乳胶层析平台测试性能良好。

c.在荧光免疫层析平台，采用HPIV-3抗体配对测试HPIV-3抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达1ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在荧光免疫层析平台测试性能良好。

d.特异性：分别测试浓度为10ug/mL的腺病毒抗原、合胞病毒抗原、2019-nCOV-SRFc3cho抗原、2019-nCOV-SRHcho抗原、HPIV-1抗原、HPIV-2抗原，结果均为阴性，表明特异性良好。

图6 胶体金层析平台测试HPIV-3抗原梯度示意图

图7 彩色乳胶层析平台测试HPIV-3抗原梯度示意图

表3  HPIV-3抗体配对荧光层析平台测试HPIV-3抗原梯度数据

样本编号	HPIV3抗原梯度（ng/mL）	T	C	T/C	区分度
1	500	239432	137295	1.744	217%
2	200	138840	172833	0.803	144%
3	100	86753	155019	0.560	182%
4	50	50523	164212	0.308	254%
5	20	18566	153430	0.121	187%
6	10	11061	170507	0.065	230%
7	5	3662	130000	0.028	410%
8	1	1175	171118	0.007	280%
9	0	394	160472	0.002	/
10	0	381	149609	0.003	/

产品名称	货号	推荐配对
副流感病毒1&3型（HPIV-1&3）单克隆抗体	FKY0933D	HPIV-1:副流感病毒1&3型单克隆抗体（货号：FKY0933D）标记胶体金/乳胶/荧光微球+副流感1型单克隆抗体（货号：FKY0933C）划膜（胶体金/乳胶/荧光层析配对组合） HPIV-2:副流感病毒2型单克隆抗体（货号：FKY0934C）标记胶体金/乳胶/荧光微球+副流感病毒2型单克隆抗体（货号：FKY0934D）划膜（胶体金/乳胶/荧光层析配对组合） HPIV-3:副流感病毒1&3型单克隆抗体（货号：FKY0933D）标记胶体金/乳胶/荧光微球+副流感病毒3型单克隆抗体（货号：FKY0935C）划膜（胶体金/乳胶/荧光层析配对组合）
副流感病毒1型（HPIV-1）单克隆抗体	FKY0933C
副流感病毒2型（HPIV-2）单克隆抗体	FKY0934D
副流感病毒2型（HPIV-2）单克隆抗体	FKY0934C
副流感病毒3型（HPIV-3）单克隆抗体	FKY0935C
副流感病毒1型（HPIV-1）抗原	EKY0221B
副流感病毒2型（HPIV-2）抗原	EKY0221C
副流感病毒3型（HPIV-3）抗原	EKY0221D
副流感1&3型抗体（货号：FKY0933D）-胶体金浓缩液	DKY1339A
副流感1&3型抗体（货号：FKY0933D）-乳胶浓缩液	DKY1339B
副流感1&3型抗体（货号：FKY0933D）-荧光微球浓缩液	DKY1339C
副流感2型抗体（货号：FKY0934C）-胶体金浓缩液	DKY1340A
副流感2型抗体（货号：FKY0934C）-乳胶浓缩液	DKY1340B
副流感2型抗体（货号：FKY0934C）-荧光微球浓缩液	DKY1340C
副流感病毒2型（HPIV-2）室内质控品	EEI0330A
胶体金（40nm，1OD）	DXJ9917B-100ml
红色羧基乳胶微球，400nm	DEG0809A-10ml
时间分辨荧光微球，羧基（200nm）	AEG0786B

西宝生物作为体外诊断上游原料综合供应商，全方位助力IVD试剂盒开发，可为客户提供呼吸道项目多指标检测原料，其他相关产品请参考

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