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公司新闻
EVAGLAX(TM)细胞外囊泡分离纯化试剂盒使用说明
发布时间：2023-05-09 09:06 | 点击次数：793
EVAGLAX?细胞外囊泡分离纯化试剂盒使用说明
EVAGLAX采用了孔径精确可控、并带有抗蛋白质非特异性吸附涂层的多孔玻璃作为过滤膜。无需使用超速离心机即可简便快速地提取来自细胞外囊泡的RNA和蛋白质。同时，离心柱类型易于操作，简化了实验流程，有望减少操作的个体差异，确保实验的重现性。
用途
- 用于早期诊断和治疗选择的细胞外囊泡衍生生物标志物提取
- 生物标志物研究、细胞外囊泡基础研究
- 可用于体液（血清、血浆、尿液等）和细胞培养上清等
特征
- 孔径精确可控的三维多孔玻璃技术
- 抗杂质蛋白质非特异性吸附的涂层技术
- 简便快速地分离细胞外囊泡（15 分钟）
- 基于尺寸排阻色谱法的原理，可以无偏差地捕获细胞外囊泡
关键技术
- 多孔玻璃的孔径精确可控，根据尺寸排阻色谱法的原理，可选择性的捕捉细胞外囊泡大小的粒子。
- 滤膜表面涂有抗杂质蛋白质非特异性吸附的涂层，可抑制白蛋白等杂质蛋白的吸附。
- 通过与清洗液配合使用，可提高滤膜中捕获的细胞外囊泡的纯度。
操作流程
1.预处理
用?0.22 μm 针筒式过滤器预处理样品。
2.细胞外囊泡捕获
将样品?(100-500uL) 注入离心柱中并离心?10 分钟。
3.洗涤
将清洗液注入离心柱中并离心?5 分钟。
4.提取
使用市售的提取试剂从离心柱中提取?RNA 和蛋白质进行分析。
用?0.22 μm 针筒式过滤器预处理样品。
2.细胞外囊泡捕获
将样品?(100-500uL) 注入离心柱中并离心?10 分钟。
3.洗涤
将清洗液注入离心柱中并离心?5 分钟。
4.提取
使用市售的提取试剂从离心柱中提取?RNA 和蛋白质进行分析。
产品组成
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商品
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20 次检测
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100次检测
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离心柱
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20件
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100件
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收集管(1.5mL)
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20件
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100件
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洗涤缓冲液A
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10mL
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50mL
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洗涤缓冲液B
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10mL
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50mL
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本试剂盒以外的、需要额外准备的耗材
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类别
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耗材种类
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产品名
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厂家
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型号
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通用
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0.2μmPre-filter
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Minisart Syringe Filter0.2μm
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Sartorius
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S6534FMOSK
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通用
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1mLSyringe
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-
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-
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-
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通用
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1.5mL low protein adsorption tube
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-
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-
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-
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通用
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2.0mL low protein adsorption tube
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-
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-
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-
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对于RNA
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miRNeasy
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miRNeasy Micro Kit
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QIAGEN
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217084
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对于蛋白质
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M-PER
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Mammalian Protein Extraction Reagent
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Thermo Fisher Scientific
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78501
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保存条件
将试剂盒存放在2-10°C的冷藏环境中。
使用目的
本产品仅供研究使用。请不要将本产品用于人类或动物的医学或临床诊断。
细胞外囊泡分离步骤
【样品制备过程】
- 如果标本已冷冻，请确保在4°C下解冻。
- 使用?0.2μm滤膜过滤样品
*如果标本粘度高或者含有大量碎屑，建议先进行粗离心10,000G/30 min，然后用?0.2μm滤膜过滤上清液。?粗离心时，建议取上清后留150μL。
【细胞外囊泡捕获过程】
- 将100-500μL样品添加到离心柱中。
- 以6,000G离心10分钟。（如果转速不足，追加10,000G/3分钟离心）
*如果担心样品堵塞，请将离心机的温度设置为25°C。
- 丢弃含有流出液的外管，将内管插入一个新的1.5mL低蛋白吸附的收集管。
（*如果样品中有杂质，可选择追加以下操作：
①样品中的杂质略高的情况
- 向离心柱中加入100μL洗涤缓冲液A，并以3,000G/5分钟离心。
- 丢弃含有流出液的外管，将内管插入一个新的2mL低蛋白吸附的收集管。
②样本中的杂质含量高的情况
- 将300μL洗涤缓冲液B放入离心柱并以3,000G/5分钟离心。
- 丢弃含有流出液的外管，将内管插入一个新的2mL低蛋白吸附的收集管。
细胞外囊泡裂解步骤
【蛋白质提取工艺】
- 向离心柱中加入100uL M-PER ，并以500G/1分钟离心。
*请勿丢弃流出液。使用2.0 mL低蛋白吸附的收集管，无需更换。
- 在室温下保持5分钟?。
- 以6,000G/5分钟离心。（或者10,000G/3分钟，视情况而定）
- 收集管中的液体即是样品。
【RNA提取过程】
- 向离心柱中加入500uLQIAzol并以500G/1分钟离心。
*请勿丢弃流出液。使用2.0mL低蛋白吸附的收集管，无需更换。
- 在室温下放置5分钟。
- 以6,000G/5分钟离心。（或者10,000G/3分钟，视情况而定）
- 将离心得到的液体转移到新的1.5mL低蛋白吸附管中。不需要离心柱。
- 加入140uLChloroform，涡旋搅拌15秒，室温放置3分钟。
- 在4°C下以12,000G离心15分钟，样品分成3层。顶部透明层是含有RNA的水层，请吸出280μL透明层，注意避免混入下面的白色和红色层，然后转移到另一个1.5mL管中。
- 添加1.5体积的100%EtOH（即420uL），并通过移液器搅拌。
-----以下是?mirNeasy 的操作步骤-----
- 将700uL（尽可能多）样品转移到RNeasyMinElute离心柱中，轻轻盖上盖子，然后在8,000G下离心15秒。丢弃流出液。
（*如果需要用于NGS，此时需进行DNase处理。使用RNase-FreeDNaseSet(QIAGEN)。添加350uL?Buffer?RWT⇒8,000G，15分钟
⇒加入DNase反应10分钟
⇒添加350uL?Buffer?RWT⇒8,000G，15分钟
请注意，如果实施此操作，则无需使用700uL?Buffer?RWT进行后续的清洗。)
⇒加入DNase反应10分钟
⇒添加350uL?Buffer?RWT⇒8,000G，15分钟
请注意，如果实施此操作，则无需使用700uL?Buffer?RWT进行后续的清洗。)
- 向离心柱中加入700uL?Buffer?RWT，轻轻盖上盖子，8,000G离心15秒。丢弃流出液。
- 向离心柱中加入500uL?Buffer?RPE，轻轻盖上盖子，8,000G离心15秒。丢弃流出液。
- 向离心柱中加入500uL?80%EtOH，慢慢盖上盖子，8,000G离心2分钟。连同流出液一起将收集管丢弃。
- 将RNeasy?MinElute离心柱放入新的收集管（2mL）。
- 以最大速度(>12,000G)离心5分钟，同时打开柱盖使其干燥。
- 将RNeasy?MinElute离心柱放入新的收集管（1.5mL）。向离心柱中加入14uL无RNase水（小容器）（注意不要粘在壁上！避免移液器吸头接触到滤膜！），慢慢盖上盖子，以最大速度(>12,000G)离心1分钟提取RNA。
（*流出液即为样品）
结果示例
EVAGLAX配合清洗液A使用
可得到与超速离心法同等的CD9强度和蛋白质纯度。※
细胞外囊泡miRNA浓度评估
EVAGLAX配合清洗液A使用，可得到与超速离心法同等的总RNA回收量。※
