外泌体与肿瘤细胞转移及恶化的关联

Epstein-Barr 病毒（EBV）阳性恶性淋巴瘤

细胞外囊泡外泌体是什么？

生物体内所有的细胞都是通过直接接触或者细胞因子、趋化因子等分泌蛋白来进行信息传递的。近年来，作为担任这种细胞间信息传递的新因子，细胞外囊泡受到了大家的关注。科学家发现，细胞外囊泡和细胞一样，由脂质双层膜构成，包含蛋白，核酸、脂质等多种物质，同时细胞外囊泡还能传递这些分子中包含的信息。

外泌体是细胞外囊泡中直径较小（50~200 nm），从核内体的多胞体（MVB:multi-vesicular body）中释放而出。以前通常采用超速离心法或者密度梯度离心法来分离外泌体，但是采用这些方法很难完全去除外泌体中来自细胞本身的杂质。为了更进一步地研究外泌体，我们一直在寻找能分离出更高纯度外泌体的方法。作者利用和光纯药研发的新型外泌体提取试剂盒，尝试进行了外泌体的分离实验。该试剂盒中的试剂能够亲和外泌体表面的磷酯酰丝氨酸,从而实现外泌体的分离。用以前的超离心方法分离出的外泌体和使用本试剂盒分离出的外泌体在电子显微镜下观察图像如图 1 所示。使用超离心法提取的外泌体中混入了很多杂质，使用本试剂盒则成功分离出高纯度的外泌体。我们期待今后这种亲和提取方法能成为一种分离外泌体的标准方法。

图 1. 使用不同分离法时外泌体纯度的比较

外泌体和肿瘤的转移和恶化

自 2007 年发现外泌体中含有 miRNA 后，科学家开展了很多通过外泌体进行生物分子运输和其生物学意义的研究。特别是根据「肿瘤细胞会分泌更多的外泌体」、「外泌体中含有肿瘤特异性抗原，而外泌体能运输这些抗原」等的研究，外泌体作为一种新的诊断和治疗的靶标受到广泛的关注。为了显示肿瘤外泌体在微环境中的活动会促使肿瘤转移和恶化，本文将为大家介绍几个相关研究成果。

肿瘤在转移到其他组织时，需要在间质细胞间移动并到达血管中。科学家们发现，在这个过程中，外泌体通过纤维连接蛋白促进肿瘤细胞的运动性，再通过 MT1-MMP 蛋白酶促进细胞外基质的分解、血管新生及血管渗透性，来促进肿瘤转移。此外，还发现了多数的肿瘤细胞对转移的组织具有指向性，而外泌体表面的整合素就是决定其指向性的因子。这些报道表明，αvβ5 整合素决定了对肝脏、α6β4 α6β1 整合素决定了对肺部的指向性。这些报告是以外泌体为中心的肿瘤细胞-微环境之间复杂交流极其重要的报告。

在上述报导的基础上，以下是作者团队独自就 EBV 阳性淋巴瘤中外泌体作用进行研究的概述。

Epstein-Barr 病毒（EBV）和恶性淋巴瘤

Epstein-Barr 病毒（EBV）是从 Burkitt 淋巴瘤培养细胞中分离的最初的人体癌症病毒。CD21 被认定为感染性受体，在试管中容易引起 B 细胞的转化。由此我们知道 EBV 编码的 LMP（latent membrane protein）及 EBNA （EBV nuclear antigen）等 9 种基因控制了细胞内信号和转录因子的活性，导致了感染细胞的永生化和形态转化。

现在，世界上 90% 的人口都携带 EBV，即处于潜伏感染状态，当由于各种各样的原因导致免疫力低下时，会引发 B 细胞性 T/NK 细胞性淋巴瘤，极少数情况下还会引发鼻咽癌或胃癌等上皮细胞肿瘤。有报告显示在部分的 B 细胞性淋巴瘤里，用传统的方法进行治疗时，EBV 呈阳性的病例比 EBV 呈阴性的病例治疗效果差，出现预后不良。人们强烈希望研发出针对EBV 阳性淋巴瘤、替代现有治疗方法的特效新疗法。作者鉴于EBV阳性疾病治疗的现状，以 EBV 阳性淋巴瘤的发病及恶化的机制为核心进行了研究。

重要的一点是，EBV 阳性淋巴瘤组织中浸润了很多免疫细胞，而肿瘤细胞依靠炎症微环境来生存。作者着眼于这点，对 EBV 阳性淋巴瘤外泌体对微环境的影响以及作为促进淋巴瘤恶化因子的 EBV 源 miRNA 活动情况进行了分析。

外泌体运送 EBV 来源的 miRNA

EBV 自身的染色体组上被称为 BART（BamHI-A rightward transcripts）的领域里有编码 miRNA 簇。这个簇中编码了大约 40 种的 miRNA，也有人称之为 BART miRNA，本文统一称为 EBV miRNA。现在，这些 EBV miRNA 在淋巴瘤发病和恶化中的作用还存在很大的争论。例如，有研究显示 EBV miRNA 抑制细胞凋亡有助于肿瘤生存，也有研究报道显示维持 EBV 的潜伏状态可以抑制肿瘤化。

在此类研究中，Pegtel 团队的研究发现，EBV 阳性淋巴瘤细胞分泌出的外泌体中含有 EBV miRNA10）。这份报告表明了外泌体选择性进入人单核细胞来源的树突状细胞（MoDC），并运送 EBV miRNA。从该结果可知，EBV 阳性淋巴瘤中的外泌体对肿瘤组织中浸润的非肿瘤细胞的活性有一定影响，还能导致微环境的改变。

外泌体对淋巴瘤发病的影响

在 Pegtel 团队的研究的基础上，作者尝试进行同样的实验时，证实了淋巴瘤中的外泌体会选择性进入单核细胞/巨噬细胞。我们发现含有大量 EBVmiRNA 的外泌体能促进巨噬细胞中 TNFα 和 IL-10 等基因的表达。这种基因的表达模式和在肿瘤微环境中浸润的 TAM（Tumor-associated macrophage）非常相似，所以吸收含有 EBV miRNA 的外泌体的巨噬细胞可能在微环境的构成中发挥重要的功能。

接着，为了确认 EBV 阳性淋巴瘤中的外泌体能促进微环境构建，作者利用了 EBV 感染的小鼠模型。本来，EBV 只会感染以人类为首的灵长类动物，但将人类脐带血中 CD34 阳性造血干细胞移植到免疫缺陷 NOG 小鼠上，如此可建立由 EBV 感染引发的淋巴瘤发病的小鼠模型。这个小鼠模型在被野生型 EBV 株（Akata）和 EBVmiRNA 缺损株（B95-8）感染后，感染野生型株的小鼠预后较差，但感染 miRNA 缺损株的小鼠恢复情况良好。对此，作者尝试对感染 miRNA 缺损株的小鼠静脉注射含有 miRNA 的外泌体，发现小鼠竟然产生了淋巴瘤，而且肿瘤组织中浸润着大量的巨噬细胞。最后我们还发现，注入 Clodronate 脂质体去除肿瘤中巨噬细胞的同时，肿瘤细胞也会减少。

上述结果表明，在 EBV 阳性淋巴瘤恶化的过程中，外泌体能利用巨噬细胞构建有利于肿瘤细胞的微环境。

综述

外泌体在刚被发现时，曾被认为是把多余的蛋白和核酸释放到细胞外的一种结构。但如今作为诊断和治疗以肿瘤为主的各种疾病的靶标而备受关注。本文着重介绍了肿瘤中外泌体的功能，并认为外泌体会参与到所有的生命现象中。虽然大多数的研究都已明确了外泌体的生物学意义，但其详细的功能还存在很多未知的部分。希望我们的研究能有助于今后对外泌体的研究。

参考文献：

[1]　Quail, D. F. and Joyce, J. A. : Nat. Med ., 19 （11）, 1423（2013）.
[2]　Tkach, M. and Thery, C. : Cell , 164, 1226 （2016）.
[3]　Valadi, H. et al . : Nat. Cell Biol ., 9（6）, 654 （2007）.
[4]　Sung, B. H. et al . : Nat. Commun ., 6, 7164 （2015）.
[5]　Hoshino, D. et al . : Cell Rep ., 5, 1159（ 2013）.
[6]　Kosaka, N. et al . : J. Biol. Chem ., 285（ 23）, 17442（ 2010）.
[7]　Zhou, W. et al . : Cancer Cell , 25, 501（ 2014）.
[8]　Hoshino, A. et al . : Nature , 527, 329（ 2015）.
[9]　Ok, C. Y. et al . : Blood , 122（ 3）, 328（ 2013）.
[10] Pegtel, D. M. et al . : PNAS , 107（ 14）, 6328 （2010）.

本文由东海大学综合医学研究所造血领域 东海大学医学部血液肿瘤内科 樋口广士、幸谷爱

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